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Smart-seq2 单细胞转录组测序

Smart-seq2 单细胞转录组测序通过 SMART 扩增技术对单个细胞中的 mRNA 进行逆转录和 PCR 扩增,结合转座酶建库技术,最终使用高通量测序手段,对单细胞中 mRNA 进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析。它可以解决传统 RNA 定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题,是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具,极大地拓展了RNA-Seq 的应用范围。

应用领域
单个细胞样本全转录本信息获取
基因注释及筛选
基因结构分析

技术路线

分析内容
标准信息分析
(需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果)
1.测序质量评估与原始数据过滤,去除接头序列及低质量reads
2.比对参考基因组或参考基因序列
3.测序与比对评估: 数据比对统计,测序饱和度分析,测序随机性分析
4.基因表达统计:基因覆盖度,表达量,表达量丰度分布
5.新基因的转录本预测及注释(需有参考基因组)
6.样本关系分析:主成分分析(PCA)、相关性检验、样本聚类图
7.差异表达基因分析(两个或两个以上样品): 差异表达基因筛选、差异基因表达模式聚类分析(热图)、差异基因GO功能显著性富集分析、差异基因Pathway显著性富集分析

高级信息分析
1.  SNP分析
2. 基因结构优化(需有参考基因组)
3. 基因可变剪切鉴定(需有参考基因组)

定制化信息分析 (请选择需要分析内容)
1. 基因表达趋势分析(需要三个或以上有处理梯度的样品):利用STEM软件将基因按照表达模式分为不同的趋势、各趋势基因的GO/KEGG功能富集分析、特定基因集聚类分析
2. 权重基因共表达网络分析(WGCNA)(至少15个样本)、根据基因表达模式进行模块划分、样本表达模式分析、模块基因表达模式分析、性状-模块相关性分析、各模块基因的GO/KEGG功能富集分析、基因间调控关系网络图

样品要求
1.真核生物,mRNA具有poly-A结构。
     细胞:推荐1-500个单细胞(可检测1-10000个);
     微量RNA: 10 pg-100ng纯化后的带poly A序列的总RNA;
2.RNA质量:一般要求28S/18S≥1,RIN≥7,浓度>50pg/uL。

项目周期
标准流程完成时间为50个工作日。

参考文献
Picelli S, Faridani O R, Björklund Å K, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature protocols, 2014, 9(1): 171.
Yan L, Yang M, Guo H, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells[J]. Nature structural & molecular biology, 2013, 20(9): 1131.
Usoskin D, Furlan A, Islam S, et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing[J]. Nature neuroscience, 2015, 18(1): 145. Björklund Å K, Forkel M, [4] Picelli S, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing[J]. Nature immunology, 2016, 17(4): 451.

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